kultur tumbuhan

Teknik kultur jaringan atau kultur in-vitro yaitu  teknik menumbuhkan organ, jaringan, sel ( protoplas) tumbuhan  secara in vitro pada media yang mengandung nutrisi di laboratorium 

dalam keadaan  aseptik.  Teknik ini didasari oleh teori totipotensi sel, yaitu teori yang mengatakan bahwa sel tumbuhan  berpotensi  untuk tumbuh menjadi tumbuhan  secara utuh.Teknik ini dipakai  untuk  perbanyakan tumbuhan  secara vegetatif dan anakan yang dihasilkan akan sama dengan induknya (true-to type).   teknik  ini lebih 

efisien sebab  dari bahan tanam yang berukuran kecil akan dihasilkan anakan dalam jumlah banyak.   Bibit tumbuhan  yang dihasilkan dengan kultur jaringan juga lebih sehat, terutama untuk 

memperbanyak tumbuhan  unggul hibrida, 

tumbuhan  unggul transgenik, tumbuhan  yang tidak memiliki biji,  tumbuhan  yang bijinya tidak memiliki cadangan makanan.   melalui kultur meristem (bagian ujung tunas yang meristematik 

dan tanpa jaringan pembuluh) dapat dihasilkan tumbuhan  bebas virus. Persilangan secara in-vitro melalui kultur dan fusi protoplas 

berhasil dilakukan .  ini    untuk mengatasi 

persilangan antar spesies/kultivar yang tidak cocok jika dilakukan di kebun .  Embryo rescue melalui kultur embrio  dilakukan melalui 

teknik kultur jaringan.   untuk menyelamatkan embrio zigotik hasil persilangan di kebun  yang  gugur sebelum menjadi biji.Target transformasi yang berwujud  sel, kalus, protokorm maupun protocorm  diproduksi, lalu  ditumbuhkan menjadi tumbuhan  secara utuh untuk menghasilkan 

tumbuhan  transgenik.  Semua proses itu   dilakukan in vitro. Permasalahan  dalam perbanyakan tumbuhan  dengan teknik kultur jaringan yaitu  kontaminasi oleh mikroorganisme, 

browning pada media dan  vitrifikasi, yang  memicu  kematian pada jaringan eksplan.  Permasalahan itu  dapat dicegah dengan  pemeliharaan  tumbuhan  donor eksplan.

Masalah lainnya yaitu variasi somaklonal yang kerap  menghasilkan fenotip menyimpang dari induknya.  Penyimpangan ini  bersifat genetik (merubah struktur dan sekuen DNA ) maupun 

epigenetik (dipicu  oleh aktivasi/in-aktivasi gen tertentu sebab  faktor lingkungan).  Namun kadang variasi somaklonal  bersifat menguntungkan jika penyimpangan itu  secara tidak sengaja menghasilkan kultivar baru yang unggul.

Aklimatisasi : masa adaptasi tumbuhan  hasil kultur jaringan yang semula keadaan nya terkendali menjadi lingkungan yang tidak terkendali (mengubah pola hidupnya dari   heterotrof ke   ototrof ). Tujuan  aklimatisasi yaitu  untuk mengkondisikan ulang tumbuhan  agar tidak terjadi stress pada waktu ditanam di kebun .

Antioksidan : zat yang mampu memperlambat atau mencegah proses oksidasi.

Arang aktif : Arang Aktif yaitu  arang yang diproses sehingga memiliki daya serap  tinggi dari  bahan yang berbentuk larutan atau uap.  Dalam kultur jaringan arang aktif  sebagai penyerap 

senyawa fenol yang tereksudasi dari jaringan 

eksplan

Aseptik : Bebas dari mikroorganisme

Auksin :  hormon  dalam kultur jaringan 

 menstimulasi pertumbuhan dan pemanjangan akar.  Auksin  alami (fitohormon) / sintetik.  Secara alami dihasilkan pada ujung tunas dan ujung akar. 

Autoklaf : Alat untuk sterilisasi dengan prinsip  steam heating. 

Bipolar : untuk pertumbuhan ke dua arah (arah tunas/ ke atas dan arah akar / ke bawah) yang dialami sel/jaringan dalam embriogenesis.

Browning :  pencoklatan yang terjadi pada media akibat oksidasi senyawa fenolik yang memicu  kematian jaringan eksplan.

Dediferensiasi :  terbentuknya sel-sel yang tidak terorganisir (kalus) dari suatu jaringan tumbuhan  yang sudah terdiferensiasi.

DNA : Deoxyribose Nucleic Acid yaitu  polynukleotida, berbentuk rantai ganda(double stranded) yang mengandung informasi genetik yang menentukan perkembangan biologis dari  bentuk kehidupan sel.

Eksplan  :  Bahan tanam awal dalam kultur jaringan / in vitro Embriogenesis 

somatik : Proses terbentuknya embrio dari sel-sel somatik.

Embryo resque :  menyelamatkan embrio zigotik yang baru terbentuk melalui kultur embrio.

Fenolik : Senyawa metabolit sekunder yang dihasilkan oleh jaringan tumbuhan .

In vitro : Di dalam botol (gelas bening).

Kalus : Se-sel hidup yang tidak terorganisir.

Kontaminasi : Terserang oleh mikroorganisme.

Mikropropagasi : Perbanyakan tumbuhan  dengan teknik kultur jaringan.

Mikrospora : Sel kelamin jantan/gamet jantan pada tumbuhan  yang nantinya berkembang menjadi polen atau butir-butir serbuk sari

Kultur Jaringan tumbuhan 

Monopolar :  pertumbuhan ke satu arah (tunas atau akar) dalam organogenesis.

Organogenesis : Proses terbentuknya organ dari sel/jaringan eksplan yang ditanam.

Pengakaran : Tahap menumbuhkan akar dalam kultur jaringan dari tunas yang sudah terbentuk.

tanaman  : tumbuhan  yang dihasilkan dari perbanyakan melalui kultur jaringan / in vitro.

Ploriferasi : Perbanyakan bentuk yang sama secara cepat. contoh  dalam kultur jaringan terjadi proliferasi kalus atau proliferasi tunas.

Polyphenol 

oxidase (PPO):Enzim yang bersifat oksidatif dan berperan dalam terjadinya browning dalam kultur jaringan akibat teroksidasinya senyawa fenolik oleh enzim PPO

Propagul : bentukan baru yang muncul dari jaringan eksplan, dapat berwujud  tunas maupun kalus.

Protokorm : Struktur yang muncul dari biji tumbuhan  anggrek yang berkecambah, berwarna  kuning kehijauan.

Protocorm Like Bodies (Plb) :Struktur  mirip  protocorm yang muncul dari kultur sel/jaringan somatik

Protoplas : Sel tanpa dinding sel

Rekayasa genetika :Perekayasaan terhadap genom tumbuhan  sehingga dihasilkan tumbuhan  transgenik.

Root Apical  Meristem : Meristem ujung akar

Shoot Apical  Meristem : Meristem ujung batang 

Sitokinin : Kelompok hormon tumbuhan yang  

berfungsi untuk pembelahan sel (sitokinesis), 

sedang  dalam kultur jaringan berfungsi untuk 

menstimulasi pertumbuhan tunas.  Ada yang 

bersifat sintetik / alami.  Sitokinin alami 

dihasilkan di bagian akar tumbuhan ,

Subkultur : Memindahkan kultur ke media baru 

Kultur Suspensi : Kultur cair

Totipotensi sel : Kemampuan setiap sel tumbuhan  untuk beregenerasi membentuk tumbuhan  secara utuh.

Variasi somaklonal : Variasi fenotip menyimpang  yang muncul pada anakan hasil perbanyakan melalui teknik kultur jaringan.

Vitrifikasi : keadaan  tumbuhan  yang sel-selnya mengandung air berlebihan sehingga terjadi kerusakan secara fisiologi , ditandai dengan fenotip organ yang bening (glassy).

 

Kultur jaringan tumbuhan  yaitu  suatu teknik  menumbuhkan sel, jaringan atau  irisan organ tumbuhan  di laboratorium pada suatu media buatan yang mengandung nutrisi yang aseptik (steril) untuk menjadi tumbuhan  secara utuh.  keadaan  steril yaitu  suatu syarat mutlak keberhasilan pelaksanaan kultur jaringan, sehingga keadaan  ini harus tetap dijaga selama proses kultur  berlangsung.  walau  hanya satu spora jamur atau hanya satu sel bakteri yang masuk ke media kultur, maka pekerjaan kultur akan gagal dan tidak akan dihasilkan tumbuhan  baru. Kultur jaringan tumbuhan  didasari oleh teori totipotensi sel (cellular totipotency) yang mengatakan bahwa setiap sel tumbuhan  memiliki 

kapasitas untuk beregenerasi membentuk tumbuhan  secara utuh tumbuhan  baru yang diperoleh dengan cara ini bersifat identik dengan induknya, dan dinamakan  tanaman .Jumlah tumbuhan  baru yang dihasilkan tidak hanya satu, namun bisa puluhan hingga ratusan (dari satu bahan tanam atau eksplan) sehingga teknik kultur jaringan dipakai  sebagai prinsip  perbanyakan tumbuhan . prinsip  perbanyakan tumbuhan  yang dilakukan dengan teknik kultur  jaringan tergolong perbanyakan vegetatif, artinya tidak melibatkan 

adanya fertilisasi antara sel telur dan sel kelamin jantan seperti halnya pembentukan biji pada tumbuhan , itu sebabnya  tanaman  yang dihasilkan 

identik dengan induknya.  Perbanyakan tumbuhan  dengan teknik kultur jaringan dinamakan  juga mikropropagasi atau perbanyakan mikro.  Kata 

mikro mengacu pada bahan tanam awal yang dipakai  yaitu eksplan yang berukuran kecil (micro=kecil), bahkan dapat mencapai ≤ 1 mm 

pada kultur meristem.Kultur Jaringan tumbuhan 

Dibandingkan dengan perbanyakan vegetatif konvensional seperti  budding, layerage,  stek, cangkok, mikropropagasi memiliki kelebihan dan kekurangan , mikropropagasi memiliki keunggulan dari segi bahan tanam awal yang sangat kecil 

namun menghasilkan anakan yang jauh lebih banyak.  Dibandingkan dengan perbanyakan vegetatif konvensional, perbanyakan dengan 

mikropropagasi akan jauh menjadi lebih efisien untuk tumbuhan  yang memiliki nilai ekonomi tinggi, sebab  biaya hak cipta  yang mahal 

akan tertutupi oleh harga jual tumbuhan  yang tinggi.

Sejarah singkat perkembangan kultur jaringan tumbuhan  secara kronologis ;

 

Tahun 1902     C.Haberlant

Orang pertama yang mengkulturkan  sel tumbuhan  secara in vitro pada medium buatan

Tahun 1922     WJ Robbins dan W. Kotte

Kultur akar dalam jangka pendek (kultur organ)

Tahun 1934     P R White 

Demonstrasi  kultur akar tomat 

Tahun 1939       R J Gautheret dan P Nobecourt

Pengkulturan kalus pertama dan dalam jangka waktu relatif lama memakai  eksplan dari jaringan 

empulur pada wortel,

Tahun 1939        P R White

Kultur kalus dari jaringan tumor pada tembakau hibrid hasil persilangan antar spesies of Nicotina 

glaucum X N.longsdorffi 

Tahun 1941     J Van Overbeek 

Penemuan pemakaian  air kelapa untuk kultur embrio pada wortel.

Tahun 1942     P R White dan A C Braun

menumbuhkan jaringan tumbuhan  yang  bebas tumor,Penelitian pada crown gall dan 

pembentukan tumor pada tumbuhan  

Tahun 1948      A Caplan dan F C Stewart

pemakaian  santan kelapa ditambah  2,4-D untuk proliferasi pada kultur jaringan wortel dan kentang.

Tahun 1950.     G Morel 

Kultur jaringan tumbuhan  monokotil memakai  santan kelapa.Kultur Jaringan tumbuhan ,

Tahun 1953      W H Muir

Penemuan teknik kultur sel dengan melakukan kultur sel yang berasal dari kalus .

Tahun 1953 W Tulecke 

Kultur haploid dari polen tumbuhan Gymnospermae (tumbuhan berbiji terbuka)

Tahun 1955   C O Miller, F Skoog  ,

menemukan faktor-faktor yang memicu  pembelahan sel,Penemuan sitokinin,yaitu Kinetin

Tahun 1955     E bal 

Kultur jaringan tumbuhan  Gimnospermae .

Tahun 1957    F Skoog dan  C O Miller

hipotesa  bahwa pembentukan akar atau tunas dari kultur kalus diregulasi oleh proporsi 

atau rasio auksin dan sitokinin dalam medium.

Tahun 1960.     E C Cocking 

Isolasi protoplas memakai  enzim dan  kultur protoplas.

Tahun 1960    G Morel 

Pengembangan teknik kultur  tunas apikal.  

Tahun 1964     G Morel 

 mengembangkan teknik kultur meristem dan memperoleh  anakan tumbuhan  anggrek yang bebas  virus dari induk tumbuhan  yang 

terjangkit virus.

Tahun 1966    S G Guha and S C Maheshwari

Kultur anter dan kultur polen , memperoleh  embrio haploid.

Tahun 1974 J P Nitsch

Kultur mikrospora dari tumbuhan  Datura dan Nicotiana untuk menggandakan jumlah kromosom 

dan panen biji dari tumbuhan  double haploid yang homozigot dalam waktu 5 bulan.

Tahun 1978      G Melchers Fusi 

protoplas untuk memperoleh  hibrid somatik

Tahun 1983   K A Barton , W J  Brill , J H Dodds 

Bengochea

Insersi gen dengan memakai  vector plasmid memakai  target transformasi berwujud  protoplas 

tumbuhan .

.

Tahun 1983      M D Chilton

Transformasi gen pada masing-masing sel 

tumbuhan  tembakau dan   transgenik.

Eksplan , yaitu  istilah  bahan tanam awal yang dipakai  dalam mikropropagasi.  Eksplan  berwujud  sel (kultur sel), protoplas  (kultur protoplas), epidermis, empulur (kultur jaringan), meristem apikal atau lateral (kultur meristem), tunas apikal maupun lateral (kultur tunas), 

dan  irisan batang, daun maupun akar (kultur organ).  Dengan melihat lihat   bahan tanam yang dipakai , maka istilah kultur in vitro lebih tepat 

dipakai  untuk mikropropagasi dibandingkan kultur jaringan sebab  yang dikulturkan sangat bervariasi , bukan hanya jaringan.  In vitro berasal 

dari bahasa Latin yang berarti di dalam gelas (dalam bahasa Inggris in glass), untuk menggambarkan   proses biologi yang berlangsung di dalam tabung gelas atau botol kultur, di luar tubuh mahluk hidup.Eksplan itu  ditanam pada media tanam steril yang 

mengandung nutrisi.  Adanya senyawa fenol pada jaringan tumbuhan , kerap  memicu  eksplan berubah warna menjadi coklat dan diakhiri dengan kematian jaringan eksplan.  Warna coklat dipicu  

oleh peran enzim polyfenoloksidase yang mengoksidasi senyawa fenol yang keluar dari irisan eksplan.  Senyawa fenol yaitu  metabolit 

sekunder dan tersimpan dalam vakuola sel tanamn.  saat  eksplan diiris, vakuola pecah sehingga terjadi eksudasi senyawa fenol dan 

teroksidasi.  Istilah pencoklatan eksplan ini dinamakan  browning.  Efek oksidasi senyawa fenol ini juga bisa memicu  pencoklatan pada 

media kultur.  Istilah pencoklatan pada media ini  dinamakan   staining atau browning. Eksplan yang masih hijau pada media yang mengalami browning harus dipindah ke media baru.  Pemindahan kultur ke media baru dinamakan  

subkultur.   beberapa alasan dilakukannya subkultur selain pencoklatan media, diantaranya yaitu :  media terkontaminasi oleh 

mikroorganisme, namun eksplan masih sehat, media kultur mengering populasi kultur sudah terlalu padat; dilakukannya pengakaran (rooting) 

sehingga harus disubkultur ke media induksi akar. Eksplan yang ditanam akan membentuk bentukan baru sebelum menjadi tanaman .  Bentukan baru yang terbentuk sesudah  eksplan ditanam pada media kultur dinamakan  propagul.  Propagul  berwujud  kalus, organ Kultur Jaringan tumbuhan ,(tunas, akar) atau  embrio somatik.  Kalus yaitu  kumpulan sel yang tidak terorganisir.  Kalus terbentuk jika  eksplan ditanam pada media 

yang ditambah dengan zat pengatur tumbuh (ZPT) untuk menginduksi kalus, contoh  ZPT golongan sitokinin dan auksin dengan konsentrasi 

yang sama atau ZPT 2,4-Dichloropenoxy acetic acid (2,4-D).  Istilah dediferensiasi diberikan untuk eksplan berwujud  organ tumbuhan  yang 

sudah terdiferensiasi seperti daun, batang, tunas, akar yang membentuk kalus.  Organ tumbuhan  itu  yang sel-selnya sudah terdiferensiasi dikembalikan lagi menjadi tidak terdiferensiasi.  Jika nanti kalus-kalus ini kembali membentuk tunas, dinamakan  mengalami rediferensiasi.

Kultur jaringan dimanfaatkan untuk  tujuan :

-Perbanyakan tumbuhan  hibrid yang  bersifat  unggul. tumbuhan  hibrid yaitu  hasil persilangan antara 2 tumbuhan  yang masing-masing membawa sifat  khusus , sehingga sifat  yang dimiliknya yaitu   kombinasi  yang berasal dari dua tertua .  tumbuhan  hibrid harus diperbanyak 

secara vegetatif untuk mempertahankan sifat unggul yang  dimilikinya.  Kultur jaringan yaitu  prinsip  perbanyakan vegetatif sehingga sangat tepat dipakai  untuk perbanyakan  tumbuhan  hibrid.

- Memperbanyak GM (Genetically Modified) Plants atau  tumbuhan  transgenik. tumbuhan  transgenik bersifat  agronomi yang khusus  sesuai dengan gene of interest yang disisipkan. 

Perbanyakan tumbuhan  ini harus dilakukan secara vegetatif agar anakan yang dihasilkan secara genetis identik dengan induknya. 

Perbanyakan tumbuhan  melalui kultur jaringan  mempercepat  Kultur Jaringan tumbuhan 

proses perbanyakan   seragam  identik secara genetik dengan induknya.

- Memperbanyak tumbuhan  yang tidak memiliki biji  tumbuhan  tanpa biji seperti pisang harus diperbanyak secara vegetatif. Secara vegetatif konvensional pisang diperbanyak melalui anakan dan atau mata bonggol.  Namun perbanyakan 

tumbuhan  pisang dengan teknik kultur jaringan biasa  dilakukan oleh pelaku agribisnis untuk komoditi pisang secara komersial.  Selain diperoleh bibit dalam jumlah banyak dengan 

waktu yang relatif singkat, juga diperoleh bibit yang seragam dan sehat, Di Malaysia contoh , agribisnis pisang mas dilakukan secara besar-besaran dengan bibit pisang yang diperoleh melalui  kultur jaringan,  Buah pisang ini diekspor ke  negara kita ,Singapura, Hongkong,

-Mempermudah pengiriman tumbuhan  dalam container steril, Pengiriman tumbuhan jarak jauh dapat dipermudah jika tumbuhan  yang dikirim itu  berukuran relatif kecil dan  bebas patogen. 

Bebas patogen diperlukan untuk mengatasi masalah karantina yang biasanya disyaratkan oleh negara tujuan.  Ukuran tumbuhan  

yang  kecil dan    steril hanya dimungkinkan jika 

tumbuhan  itu  dihasilkan melalui kultur jaringan.

- Teknik kultur jaringan  dipakai  sebagai teknik perbanyakan tumbuhan ,seperti transformasi rekayasa genetik juga memerlukan  teknik kultur jaringan jika transfer gen dilakukan secara in vitro. Jadi teknologi menghasilkan tumbuhan  transgenik secara in vitro mutlak memerlukan kultur jaringan.  Menumbuhkan target transformasi berwujud  kalus, protocorm like bodies maupun  tunas in vitro untuk menjadi calon  tanaman  transgenik, 

-Memperbanyak tumbuhan  yang bijinya sulit berkecambah Nepenthes, Anggrek,  tumbuhan  anggrek dan Nepenthes yaitu  jenis tumbuhan  yang memiliki biji yang sulit berkecambah pada keadaan  normal pada media tanah seperti  jenis tumbuhan  angiospermae  (tumbuhan berbiji) lainnya.  Jenis tumbuhan  ini memiliki biji sangat 

kecil, tanpa cadangan makanan (atau kalaupun ada, sangat sedikit), sehingga biji itu  memerlukan cadangan makanan dari luar (eksternal) untuk berkecambah.  Pada penanaman secara in vitro 

di laboratorium, biji-biji jenis tumbuhan  ini ditanam pada media steril yang mengandung nutrisi dan sukrosa, yang dipakai  oleh embrio biji untuk tumbuh dan berkecambah.  Selain tidak 

tersedianya cadangan makanan eksternal, penanaman secara normal pada media tanah dapat memicu  biji-biji anggrek yang sangat kecil itu  dimakan serangga seperti semut atau 

hanyut oleh siraman air.

- Beberapa spesies tumbuhan  embrionya tidak berkembang sesudah  terjadinya fertilisasi.  Untuk masalah  seperti ini maka dilakukan kultur embrio.  Penyelamatan embrio melalui kultur embrio ini 

dinamakan  embryo rescue.  contoh  para breeder (pemulia tumbuhan ) jeruk keprok di Balai Penelitian Hortikultura di negara kita  melakukan kultur embrio sesudah  melakukan persilangan jeruk secara konvensional.  ini  dipicu oleh gugurnya bunga sesudah  fertilisasi terjadi sehingga para pemulia jeruk melakukan kultur embrio sesudah  melakukan persilangan buatan.

- Menghasilkan tumbuhan  double haploid melalui kultur  mikrospora Dihasilkannya tumbuhan  double haploid yang homozigot melalui  kultur mikrospora atau kultur anther memiliki arti yang penting  bagi bidang pemuliaan tumbuhan sebab  cara ini dapat mempersingkat waktu yang diperlukan  pemulia tumbuhan  secara 

konvensional.

-Menghasilkan tumbuhan  bebas virus dari kultur meristem, Meristem yaitu  bagian tumbuhan  yang sel-selnya bersifat  meristematik (aktif membelah).  Meristem terletak di ujung tunas (apikal maupun aksilar) dan ujung akar.  Jaringan pembuluh 

(xylem dan phloem) belum berkembang pada meristem dan  virus biasanya ada pada jaringan pembuluh, sehingga meristem menjadi bebas virus.  Kultur meristem yang menghasilkan 

tumbuhan  bebas virus pertama diperkenalkan oleh George Morrell  pada tahun 1960 an. Morrell kala itu memperoleh  anakan  yang bebas virus dari kultur anggrek Cymbidium yang terserang 

virus.  Hingga kini kultur meristem banyak dipakai  untuk perbanyakan tumbuhan  secara komersial 

- Tujuan dari fusi protoplas yaitu untuk menyilangkan (crossing) tumbuhan  yang dilakukan secara in vitro.  Yang pertama dilakukan 

yaitu  membuat kultur sel (dari organ dengan sel-sel somatik) dari Kultur Jaringan tumbuhan 

tumbuhan  yang akan disilangkan itu .  lalu  dilakukan isolasi protoplas yaitu dengan cara mendegradasi dinding sel dengan enzim selulase dan pektinase sehingga yang tersisa hanya 

protoplasmanya (sel tanpa dinding sel).  lalu  dilakukan kultur protoplas dan lalu  dilakukan fusi (peleburan) antara dua tipe protoplas itu  secara in vintro.  Hasil peleburan itu  lalu  ditumbuhkan untuk jadi tumbuhan .  tumbuhan  hasil perbanyakan melalui fusi protoplas ini akan membawa sifat-sifat yang diturunkan dari dua tumbuhan  yang berbeda,

Laboratorium kultur jaringan minimal memiliki 4 ruang, yaitu  ruang preparasi, ruang tanam ,ruang kultur (ruang inkubasi),dapur, 

-Ruang tanam yaitu  ruang untuk menanam kultur.  Ruangan  ini harus dijaga sterilitasnya agar pekerjaan kultur  terhindar dari  kontaminasi  ruang tanam  dilengkapi dengan lampu pembunuh mikroorganisme. Lampu ini dinyalakan 30 menit sebelum pekerjaan dimulai dan dimatikan saat  sudah mulai menanam,Pada laboratorium kultur 

yang lebih modern, sebelum memasuki ruang tanam, setiap orang harus  disterilisasi dengan memasuki ruang pembersih yang dilengkapi dengan  sprayer automatis yang menyemprotkan safety disinfectant ke tubuh orang, Di dalam ruang kultur ada  meja kerja steril  berwujud  enkas yaitu meja kerja yang sangat sederhana dan tidak memakai  daya listrik yaitu laminar air flow cabinet.  Laminar ini banyak variasinya , Ruang tanam sebaiknya dilengkapi dengan pendingin (AC) untuk memberi  kenyamanan pada pekerja kultur.

-Ruang kultur (inkubasi) yaitu  ruang untuk  menumbuhkan hasil kultur dilengkapi dengan pendingin yang bisa diatur suhunya.  biasanya suhu yang  diperlukan  berkisar 20-24° C sebab  morfogenesis dalam kultur biasanya terjadi pada kisaran suhu itu ,Di dalam ruang kultur 

diletakkan rak-rak kultur yang dipakai  untuk menaruh kultur.  Ruang ini juga harus dijaga sterilitasnya untuk menghindarkan kultur dari 

kontaminan.  Sterilitas dijaga dengan cara menyemprotkan desinfectan secara berkala dan  membersihkan ruangan dan  menyingkirkan kultur 

yang sudah terkontaminasi.  Kultur yang sudah terkontaminasi ini akan menjadi sumber kontaminan untuk kultur yang sehat,

-Dapur yaitu  tempat pencucian alat-alat sebelum disterilisasi, Di dapur ada  tempat pencucian (shink) dengan kran, bak sampah dan  rak tempat menaruh alat-alat sesudah  dicuci,

- Ruang preparasi  yaitu  tempat pembuatan media.  Pada ruangan ini diletakkan rak yang berisi zat kimia, timbangan, magnetic stirrer, kulkas (tempat zat kimia yang harus disimpan pada suhu dingin, seperti vitamin,zat pengatur tumbuh, media kemasan ) dan  meja untuk 

melakukan pekerjaan pembuatan media.  Jika autoklaf yang dipakai  untuk sterilisasi memakai daya listrik, maka alat ini juga diletakkan 

di ruang preparasi,  Namun jika autoklaf yang dipakai  yaitu  jenis yang memakai kompor, maka sebaiknya diletakkan di dapur dan tidak 

di ruangan preparasi.  Ruangan preparasi harus dijauhkan dari nyala api sebab  ada  banyak bahan kimia ,juga agar terhindar dari suhu tinggi yang mungkin dapat merusak bahan kimia yang ada di ruangan itu .  Meja yang ada di ruang preparasi juga dipakai  untuk melakukan preparasi eksplan sebelum dibawa ke ruang tanam.

  berapa peralatan  yang  dipakai  dalam kultur jaringan, antaralain:

-Rak kultur yaitu  tempat untuk meletakkan eksplan sesudah  ditanam pada media steril dan menumbuhkanya  hingga menjadi tanaman .  Rak kultur diletakkan dalam ruang kultur atau ruang inkubasi,Semua proses morfogenesis hingga terbentuknya tanaman  berlangsung di ruang kultur pada rak kultur 

- Glasswares yaitu  semua peralatan kecil yang terbuat dari bahan gelas seperti  botol kultur,gelas ukur, gelas  labu Erlenmeyer,   Alat-alat ini dapat disterilisasi dengan oven maupun dengan autoklaf. Alat-alat ini harus dibungkus dengan kertas saat sterilisasi agar keadaan  steril tetap terjaga sampai alat itu  dipakai ,Botol-botol bekas 

 dapat dipakai  untuk botol kultur. dissecting kit (perataan untuk memotong/mengiris), pinset, spatula dari bahan logam (stainlessteel).  Spatula yaitu  pengaduk atau dipakai  untuk mengambil bahan berwujud  serbuk.  Pinset  dipakai  untuk menjepit benda,   Scalpel yaitu  gagang pisau yang  berpasangan dengan  pisau  untuk mengiris , 

-Autoklaf yaitu  alat untuk sterilisasi dengan prinsip  uap panas (steam heating). Ada dua jenis jika dilihat dari daya yang dipakai,Yang pertama yaitu  autoklaf yang memakai  kompor dan yang kedua yaitu  autoklaf yang memakai  daya listrik. 

Keduanya memiliki cara kerja yang sama dalam proses sterilisasi.  Autoklaf yang memakai  daya kompor,Autoklaf dilengkapi dengan “sarangan” seperti pada dandang untuk mengukus.  Pada sarangan ini diletakkan benda yang akan disteril. 

sedang  pada dandang (dibawah sarangan) diisi dengan air untuk menghasilkan uap, mirip seperti dandang pengukus.  sesudah  benda yang 

akan disterilisasi dimasukkan, autoklaf ditutup katup uap dibiarkan tetap terbuka.  sesudah  itu autoklaf diletakkan di atas kompor (untuk 

yang memakai  daya kompor) dan dihubungkan stop kontak (yang memakai  daya listrik).  Katup uap ditutup jika sudah mengeluarkan uap agar suhu dan tekanan naik.  Perlahan suhu dan tekanan akan  naik.  Jika sudah mencapai tekanan 17,5 Psi atau suhu 121°C, kompor harus segera dikecilkan, lalu  suhu ini dijaga selama waktu yang 

diperlukan  untuk sterilisasi.  contoh  untuk sterilisasi media selama 20-30 menit, peralatan kecil dan glasswares selama 1 jam.  Untuk jenis 

autoklaf listrik, naiknya suhu sangat lambat dan tekanan 17,5 Psi dicapai  dalam waktu yang lebih lama.   lalu  stabil dalam tekanan ini tanpa harus mencabut stop kontak seperti halnya mengecilkan kompor pada autoklaf kompor,  Pada autokalf daya listrik, besaran suhu akan berjalan secara automatis sesuai pengaturan suhu yang kita lakukan. 

-oven dipakai untuk Sterilisasi juga namun hanya  

untuk alat-alat kecil dan glasswares dan tidak bisa untuk sterilisasi  media  dalam laboratorium, oven diletakkan di ruang preparasi,prinsip  sterilisasi dengan oven dikenal dengan dry heating, sebab  proses sterilisasi memakai  udara kering yang panas.  Oven ini memakai  daya listrik, dilengkapi dengan pengatur suhu dan waktu, sehingga proses sterilisasi bisa dilakukan dengan menekan tombol sesuai dengan kebutuhan.  

-Meja Kerja meja tanam, (Enkas, laminar) dalam kultur jaringan tempat yang dipakai  untuk menanam.  Enkas tidak memakai  daya listrik.  Di 

bagian depan ada  dua lubang yang dipakai  untuk memasukkan tangan pemakainya ,Bagian dalam enkas dijaga sterilisasinya dengan cara menyemprotnya dengan alkohol atau spiritus.   alat,bahan yang akan dipakai  dan  tangan pemakainya  juga disemprot dengan alkohol.  Meja kerja lainnya yaitu  laminar air fl ow cabinet 

(LAFC) (Gambar 6).  LAFC lebih modern dari enkas, memakai  daya listrik dan dilengkapi dengan lampu ultra violet (UV) yang berguna 

untuk membasmi mikroorganisme dan  lampu neon sebagai penerang. Lampu UV ini dinyalakan 30 menit sebelum LAFC dipakai  dan dimatikan segera saat LAFC mulai dipakai .  Prinsip kerja LAFC yaitu  dengan hembusan udara (air fl ow) yang steril.  Pertama udara dari luar disaring oleh filter pertama yang letaknya biasanya di bagian atas  laminar.  Udara ini lalu  memasuki sistem 

filter yang kedua dalam laminar dan menjadi steril.  Udara steril ini akhirnya dihembuskan pada 

areal meja kerja ke arah luar laminar, sehingga jika ada mikroorganisme yang masuk dari arah luar secara automatis akan terhembus ke luar 

laminar.Sama halnya seperti enkas, sebelum dan sesudah bekerja, laminar  harus disemprot dengan alkohol, Semua benda yang akan dimasukkan ke dalam laminar, termasuk tangan pemakai  juga disemprot dengan alkohol, Prinsip kerja steril yaitu  syarat mutlak dalam pekerjaan kultur jaringan.

-Timbangan  digital bervariasi  jenisnya  untuk menghitung satuan massa suatu benda dengan 

teknik digital.  Dalam lab kultur, alat ini dipakai  untuk menimbang  bahan/zat yang dipakai  dalam kultur, contoh  zat pengatur tumbuh, bahan untuk media, gula, agar, contoh  timbangan yang dipakai  dalam kultur jaringan  yaitu  timbangan analitik  dengan kapasitas timbang 210 g  dan kemampuan baca hingga 4 digit di belakang koma atau 0,0001g ,  timbangan dengan kapasitas timbang 

610 g  dan kemampuan baca hingga 2 digit di belakang koma atau 0,01g ,  Sebelum menimbang bahan, Pilihan jenis timbangan yang akan dipakai  disesuaikan dengan berat bahan yang akan ditimbang dan kapasitas timbangan.  

a= kapasitas timbang 210g;                       b=kapasitas timbang 610g

 cara pemakaian  timbangan yaitu :  Timbangan dihubungkan dengan stop kontak listrik (plug-in), lalu  tekan tombol “on/off” untuk mengaktifkan.  Sebelum dipakai  timbangan dinolkan terlebih dahulu.  sesudah  alas timbang (untuk menaruh bahan yang akan ditimbang) diletakkan pada timbangan, timbangan kembali dinolkan.  lalu  bahan yang akan ditimbang  ditaruh pada alas timbang yang sudah disiapkan.  lalu , berat benda yang ditimbang akan terbaca pada layar.  sesudah  pekerjaan penimbangan selesai, timbangan harus dibersihkan, dinolkan dan stop kontak harus dicabut.

-Magnetic stirrer untuk pemanasan (heating) dan pengadukan (stirring)  dipakai  untuk proses pembuatan media dan   larutan dari senyawa yang berbentuk padat.  Alat ini  dilengkapi dengan magnet sebagai pengaduk,

Eksplan (berwujud  sel, jaringan atau irisan organ) yang ditumbuhkan secara in vitro pada media buatan, juga memerlukan hara untuk terjadinya morfogenesis dan pertumbuhan.  media buatan itu  mengandung materi  , antaralain : 

- Hara makro (macro nutrient).

 Hara makro yaitu  unsur hara esensial yang diperlukan  dalam jumlah banyak oleh tumbuhan , yaitu magnesium (Mg),  sulfur (S),nitrogen (N),  posfor (P), kalium (K), kalsium (Ca), 

Ca untuk sintesis dinding sel, fungsi membran dan 

berperan dalam aktifnya signal sel.  

Mg yaitu  kofaktor enzim dan materi  klorofi l.  S yaitu  materi  beberapa asam amino dan beberapa kofaktor enzim.

N yaitu  materi  dalam pembentukan protein dan asam amino dalam tubuh tumbuhan , juga yaitu  elemen pada beberapa koenzim.  

P yaitu  materi  pembentukan asam nukleat (DNA dan RNA)   diperlukan  sebagai sumber energi transfer.  

K diperlukan  untuk mengatur potensial osmotik sel tumbuhan .  

- Hara mikro (micro nutrient)  yaitu  unsur hara esensial yang diperlukan  dalam jumlah sedikit oleh tumbuhan , yaitu molybdenum (Mo),ferum/zat besi(Fe), manganese (Mn), zinc (Zn), cobalt (Co), copper (Cu) ,

Fe yaitu  materi  cytochrome yang berperan dalam 

transfer electron.  Mn yaitu  kofaktor enzim, Zn berperan dalam sintesis klorofi l dan juga yaitu  kofaktor enzim.  Co yaitu  materi  beberapa vitamin.  Cu yaitu  kofaktor enzim dan 

berperan dalam reaksi transfer elektron.  Mo juga yaitu  kofaktor enzim dan materi  dari enzim nitrate reductase.  Baik hara makro maupun hara mikro, keduanya diberikan dalam bentuk 

garam inorganik.

 

- Jenis gula yang biasa  dipakai  dalam kultur in vitro yaitu  sukrosa,  jumlahnya berkisar 2-3 % atau 20-30 gram/liter media. Selain sukrosa, beberapa jenis gula lainnya yaitu  laktosa, 

galaktosa, maltosa , glukosa , fruktosa.  Gula diberikan pada media kultur sebagai sumber karbohidrat untuk respirasi sebab  tumbuhan  kultur bersifat heterotroph, tidak dapat melakukan 

fotosintesis untuk menghasilkan karbohidrat. 

- Respirasi menghasilkan energi yang dipakai  oleh sel tumbuhan  untuk melakukan pembelahan sel.  maka  gula ditambahkan pada media kultur sebagai sumber energi.

-  Vitamin diperlukan  tumbuhan  sebagai katalisator dalam berbagai proses metabolisme.  Vitamin dipakai  untuk pertumbuhan sel  dan  proses diferensiasi sel dan jaringan yang ditanam secara in vitro.  Beberapa jenis vitamin yang dipakai  dalam kultur in vitro yaitu pyridoxine, thiamin, nicotinic acid  Diantara ketiganya, yang bersifat esensial yaitu  thiamin (vitamin B1) yang 

diperlukan  untuk pertumbuhan sel tumbuhan .  Nicotinic acid dan pyridoxine (vitamin B6) diperlukan  hanya oleh spesies tumbuhan  

tertentu.   beberapa jenis vitamin lainnya yang dipakai   dalam kultur in vitro namun bersifat tidak  khusus  hanya untuk kultur tertentu, yaitu  p-amino-benzoic acid,,biotin, folic acid, ascorbic acid, ribofl avin, pantothenic acid, tocopherol (vitamin E),  

- Myo-inositol yaitu  senyawa golongan karbohidrat yang ditambahkan pada media kultur dalam jumlah sedikit untuk menstimulasi pertumbuhan sel pada banyak spesies tumbuhan . 

walau bukan tergolong vitamin, namun senyawa ini akan terpecah menjadi vitamin C dan pectin.  Myo-inositol berperan  dalam pembelahan sel, dipakai  dalam konsentrasi  50-5000 ppm.  Pada kultur kalus tembakau, dibuktikan 

bahwa hanya thiamin (dari kelompok vitamin) dan myo-inositol yang diperlukan  untuk pertumbuhan optimal kalus tembakau. 

- Zat pengatur tumbuh  biasanya ada dua golongan zat pengatur tumbuh (ZPT) yang 

dipakai  dalam kultur in-vitro, yaitu  golongan auksin dan sitokinin.  ZPT golongan auksin yang biasa dipakai  dalam kultur in-vitro yaitu : 2,4-dichlorophenoxy-acetic acid (2,4-D) , naphthalene- acetic acid (NAA),indole-3- acetic acid (IAA), indole-3- butricacide (IBA), 

  ZPT dari golongan sitokinin yaitu : BA (Benzyladenine), BAP (6-benzyloaminopurine), 2-

iP (isopentenyl adenine), kinetin (6

furfurylaminopurine), Zeatin  (6-4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butenylaminopurine) dan TDZ 

(thidiazuron).  Rasio kedua golongan ZPT ini akan mempengaruhi  arah morfogenesis yang terjadi pada kultur.  Rasio auksin yang  lebih tinggi dari sitokinin akan menstimulasi terbentuknya akar, 

sedang  rasio sitokinin yang lebih tinggi dari auksin akan menginduksi terbentuknya tunas.  Jika auksin dan sitokinin pada  konsentrasi yang sama (rasio 1) maka akan terbentuk kalus. 

Untuk pembentukan kalus juga dapat dipakai  2,4-D.  

Ada beberapa jenis ZPT lainnya yang dipakai  dalam kultur in vitro. ZPT itu  yaitu gibberellin (GA3) untuk pembentukan tunas pada spesies tertentu, dan asam absisik (ABA) untuk pematangan embrio pada proses embriogenesis somatik.  Dalam proses pembuatan larutan stok ZPT, untuk IAA, 2,4-D dan NAA dapat  dilarutkan awal dengan beberapa tetes  alkohol 95% /NaOH 1N, sedang  untuk  sitokinin  dipakai   setetes dimethylsulfoxide (DMSO) atau  HCL 1N ,Jika 

bahan sudah terlarut oleh pelarut awal, maka baru   ditambah DD water (Double distilled water) untuk mencapai  volume yang diinginkan.  pemakaian  pelarut awal ini  untuk menghindari terjadinya penggumpalan akibat tidak larutnya ZPT itu .

-  Penambahan senyawa pemadat  untuk membuat media menjadi padat maupun semi padat.  Pemadat itu  dapat berwujud  gellan gum,agar atau  agarose ,  Agar dan agarose dipakai  dalam konsentrasi 0.7-1.0% (7-10 gram per-liter media),   gellan gum 0.2-0.6% (2-6 gram per-liter media).  Gellan gum dijual dengan nama dagang Kelcogel,Gellrite, Phytagel ,Media kultur sebaiknya tidak terlalu padat agar penyerapan nutrisi 

dapat berjalan baik.  juga pada perkecambahan biji secara in-vitro, diperlukan media semi padat untuk mempermudah terjadinya perkecambahan.

- Asam amino tidak selalu harus ditambahkan pada media kultur, namun diperlukan untuk kultur sel dan kultur protoplas. pemakaian nya secara campuran atau tunggal  dari beberapa asam amino.  Asam amino menyediakan sumber nitrogen untuk pertumbuhan sel.  Senyawa nitrogen ini lebih mudah diserap oleh sel tumbuhan  dibandingkan sumber nitrogen dari garam inorganik. Asam amino yang biasa dipakai  yaitu  asparagine, L-arginine, cysteine , L-tyrosine,casein hydrolysate, L-glutamine, L-asparagine, adenine, glycine, glutamine, 

 -Senyawa organik alami seperti ekstrak pisang, ekstrak kentang ,air kelapa, santan kelapa, jus/ekstrak tomat,,kerap  ditambahkan pada media kultur untuk menstimulasi pertumbuhan sel/Kebutuhan akan jenis dan jumlahnya tergantung spesies tumbuhan nya.  contoh , untuk menstimulasi perkecambahan biji anggrek Vanda tricolor  dari Bali diperlukan  100-200 gram ekstrak tomat per-liter media, sedang  anggrek Phalaenopsis amabilis memerlukan 100 gram ekstrak tomat yang dicampur dengan 150 ml air kelapa (per-liter media) untuk menstimulasi perkecambahan bijinya.  Selain itu, penambahan arang aktif/active charcoal kadang juga 

dipakai  dalam kultur in vitro untuk tujuan tertentu, contoh  untuk mengatasi browning (pencoklatan) pada kultur organ tumbuhan  yang banyak mengandung senyawa fenol. Arang aktif 

 ditambahkan pada media kultur untuk merangsang perakaran, sebab  perakaran tumbuh lebih baik pada media yang berwarna gelap.

Beberapa jenis media yang dipakai  untuk kultur in vitro  ditambah  materi nya ,Media itu   ada yang dijual dalam kemasan jadi sehingga pemakai  hanya menimbang media dengan jumlah tertentu yang sudah tertera pada label media, lalu  menambahkan materi  lain seperti senyawa lain ,gula, pemadat  yang diperlukan.  materi  

media dasar itu   juga dijual secara terpisah, sehingga pembuatannya melalui proses pencampuran materi .  Preparasi media 

dilakukan dengan pembuatan larutan stok terlebih dahulu.  Tujuannya yaitu  untuk menghindarkan penimbangan banyak materi  secara berulang jika pembuatan media dilakukan berkali-kali.  Selain itu, untuk mempermudah penimbangan hara mikro yang diperlukan  dalam jumlah sangat sedikit.  

 cara pembuatan larutan stok dibuat untuk media dasar MS ,untuk pembuatan 1 liter media MS.:  tuang air destilasi sebanyak kurang lebih 200 ml 

ke dalam gelas beker ukuran 1000 ml.  Timbang dan masukkan secara berurutan materi  satu persatu sambil dilakukan pengadukan dengan 

stirrer pada magnetic stirrer.  

Keterangan:MS=Murashige & Skoog; G5=Gamborg; W=White; VW=Vacin &Went; 

Nitsch& Nitsch (Sumber : Saad & Elshahed, 2012).

Jika semua materi  sudah larut, terakhir ditambahkan air destilasi hingga volume mencapai 500 ml.   dipakai  air destilasi steril untuk pembuatan larutan stok. untuk 

memperkecil resiko kontaminasi.  lalu  larutan stok yang sudah homogen ini disimpan  pada suhu 4 °C.  Larutan stok Fe-EDTA disimpan 

dalam keadaan kedap cahaya dengan cara membungkus botol dengan  aluminium foil sebab  cahaya dapat merusak Fe.

Cara pembuatan media dengan memakai  magnetic stirrer yaitu  Magnetic stirrer dihubungkan dengan listrik. Gelas erlenmeyer yang akan dipakai  sebagai wadah pembuatan media diletakkan diatas magnetic stirrer.  Ukuran erlenmeyer biasanya lebih besar dari volume media yang dibuat untuk menghindari tumpahnya 

media pada saat media mendidih.  contoh  untuk pembuatan volume media satu liter, dipakai  gelas erlenmeyer 2 liter.  Pembuatan satu liter media MS dari larutan stok dilakukan dengan cara menambahkan larutan stok A, B, C, D dan E secara berurutan pada erlenmeyer/gelas beker yang sudah berisi kurang lebih 400 ml air destilasi.  

Volume larutan stok yang dipipet tergantung dari konsentrasi stok yang dibuat dan volume larutan stok.  Yang pertama harus dicari yaitu  konsentrasi larutan stok sebetulnya.  contoh  untuk volume 500 ml stok dengan “50 x konsentrasi”.  sebab  volume larutan stok yaitu  500 ml, sementara yang ditimbang yaitu  50 

x konsentrasi (dari materi  untuk pembuatan 1000 ml media), berarti konsentrasi larutan stok yaitu  (1000/500) x 50 = 100 kali.  Untuk membuat 1000 ml media, maka yang dipipet didapat dengan rumus 

V1N1 = V2N2

V1=1000 ml (media yang akan dibuat), N1=konsentrasi media yang 

akan dibuat (dalam ini  1 kali), V2= volume larutan stok yang harus dipipet, N2=konsentrasi larutan stok (dalam ini  100 kali). Maka akan di dapat V2=(1000x1)/100=10 ml.

 ZPT atau senyawa organik alami (jika diperlukan) ditambahkan sesuai dengan konsentrasi yang diperlukan .  lalu  ditambahkan gula sebanyak 20-30 gram, diaduk terus dengan magnet stirrer hingga homogen.  Air destilasi ditambahkan hingga volumenya 1000 ml dan dilakukan penyesuaian pH menjadi 5.6-5.8 dengan menambahkan NaOH (jika terlalu asam) atau HCl (jika terlalu basa).  sesudah  penyesuaian 

pH, ditambahkan pemadat, diaduk terus sambil dipanaskan hingga suhu 80oC.  Suhu ini yaitu  suhu maksimal untuk menjaga agar bahan 

aktif yang terkandung dalam  zat kimia tidak rusak.  Larutan media itu  lalu  dituang dalam botol-botol kultur steril (volume media biasanya sekitar 25-30 ml per botol), ditutup dan disterilisasi dengan autoklaf.  Lamanya sterilisasi tergantung volume media 

Skala = 1 cm  

Gambar 8. Media kemasan jadi MS (kiri) dan materi  MS yang dijual secara terpisah (kanan)

pekerjaan kultur jaringan antaralain tiga tahap samapi penanaman kultur (culture hak cipta ) dan tiga tahap sesudah  itu sebelum dipindah ke kebun , yaitu:

-   Isolasi bahan tanam (eksplan) dari tumbuhan  induk

-   Sterilisasi eksplan

-  Penanaman eksplan pada media steril yang sesuai (culture hak cipta ).  sesudah  eksplan ditanam, ada 4 tahap  lagi yang diperlukan sampai tumbuhan  siap ditanam di kebun , yaitu:

Pemindahan tumbuhan  ke kebun ,Aklimatisasi,Pengakaran,Pengakaran,

Isolasi bahan tanam dimulai dari pemilihan dan pemeliharaan tumbuhan  induk.  tumbuhan  induk yang dipilih harus sehat, bebas penyakit  dan memiliki pertumbuhan yang baik.  ini  diperlukan agar bahan eksplan yang dipakai  dalam kultur jaringan tidak menjadi sumber kontaminan sehingga keadaan  aseptik kultur tetap terjaga.  Sebelum eksplan diambil, tumbuhan  induk dapat diberi perlakuan, contoh  penyemprotan dengan pestisida untuk menjaga kesehatan tumbuhan  dan  diberi pupuk agar pertumbuhan vigor.  Penyemprotan ZPT jenis sitokinin dan atau pemangkasan tunas apikal dapat dilakukan pada tumbuhan  induk jenis dikotil untuk merangsang pertumbuhan tunas lateral.  Tunas lateral 

yang baru tumbuh ini baik dipakai  sebagai bahan eksplan, sebab  bahan eksplan dengan sel-sel yang masih aktif membelah (tunas yang 

baru tumbuh) memiliki daya regenerasi yang tinggi.contoh sterilisasi eksplan yang  sederhana. Bahan tanam yang dipilih (contoh  daun tumbuhan  stroberi) diambil dari tumbuhan  induk, lalu  dipotong menjadi lebih kecil dengan cara menghilangkan bagian-bagian yang tidak diperlukan.  lalu  dicuci bersih dengan detergen (disikat dengan sikat gigi yang lembut) dibawah air kran yang mengalir.  lalu  bahan tanam direndam dengan fungisida (konsentrasi 2 gram per liter) selama 10 menit sambil digoyang.  sesudah  itu dibilas dengan air steril tiga kali  lalu  

dimasukkan dalam laminar.  Dalam laminar, bahan tanam disterilisasi lagi dengan memakai  sodium hipoklorida atau clorox.  Pemutih 

pakaian dapat dipakai  sebagai pengganti sodium hipoklorida sebab  bahan aktif ini terkandung di dalam walau ada pencampur lain ,Perendaman dengan clorox dilakukan dua kali.  Yang pertama, direndam pada clorox dengan konsentrasi 10% selama 5 

menit (sambil digoyang), lalu  dibilas air destilasi steril hingga 3 kali.  Yang kedua, dengan clorox konsentrasi 5% selama 5-7 menit, lalu  dibilas lagi dengan air steril hingga 3-4 kali.  Pada beberapa 

spesies tumbuhan  juga dipakai  antibiotik untuk mengeliminasi bakteri, contoh  pemakaian  cefotaxime dengan konsentrasi 300 ppm. 

lalu  juga dibilas dengan air steril hingga 3 kali.

Yang perlu diperhatikan dalam sterilisasi permukaan bahan eksplan yaitu  konsentrasi sterilan dan lamanya perendaman.  Angka 

yang tepat biasanya diperoleh melalui penelitian awal (trial and error), sebab   khusus  untuk masing-masing spesies tumbuhan  dan  

jenis dan usia  bahan eksplan.  Konsentrasi yang terlalu tinggi akan memicu  kematian pada sel-sel tumbuhan , sedang  konsentrasi yang terlalu rendah tidak efektif sebab  tidak mampu membasmi mikroorganisme yang ada di permukaan eksplan.Jika tumbuhan  induk sumber eksplan yaitu  tumbuhan  hasil kultur dan berada dalam botol kultur, maka prosedur sterilisasi ini 

tidak diperlukan.  contoh  jika bahan eksplan yaitu  perkecambahan  (bibit) anggrek dalam botol, maka sterilisasi bahan eksplan tidak diperlukan 

sebab  tumbuhan  induk sumber eksplan sudah steril.

Eksplan yang sudah steril lalu  dipotong menjadi bagian yang lebih kecil, contoh  menjadi pangkal dan ujung daun, lalu  ditanam pada media steril yang sudah disiapkan.Media tanam yang dipakai  mengandung ZPT tertentu tergantung dari tujuan kultur.  Jika yang diinginkan yaitu  pembentukan 

kalus, maka bahan eksplan ditanam pada media induksi kalus, contoh  media dengan 2,4-D.  juga jika tujuannya untuk menginduksi tunas maka ditanam pada media untuk induksi tunas, contoh  media yang mengandung sitokinin atau mengandung GA3.  ,eksplan daun stroberi yang ditanam pada media yang mengandung 5 ppm GA3 untuk induksi tunas dan eksplan berwujud  

umbut kelapa sawit yang ditanam pada media MS dengan 3 ppm 2,4-D untuk induksi kalus.  Umbut yaitu    tunas apikal yang meristematik pada kelompok tumbuhan  palma (palem-paleman) termasuk kelapa sawit.

a= eksplan daun stoberi; b= eksplan umbut kelapa sawit; skala = 0.5 cm.  

keadaan  aseptik harus tetap dijaga selama proses penanaman, baik ruang tanam, pekerja dan juga alat-alat yang dipakai  untuk menanam. 

keberhasilan  kultur jaringan  dipengaruhi oleh kemampuan  menjaga keadaan  aseptik.

l 

Propagul yaitu  bentukan baru hasil morfogenesis yang terbentuk dari jaringan eksplan yang ditanam.  Propagul  berwujud  kalus, tunas atau embrio somatik.  Proliferasi itu  dapat dilakukan 

dengan melakukan subkultur ke medium baru, dapat berwujud  medium induksi kalus untuk perbanyakan kalus dan medium induksi tunas 

untuk perbanyakan tunas.  Proliferasi embrio somatik dilakukan dengan subkultur pada media tanpa hormon sesudah  sebelumnya diinisiasi 

pembentukannya dengan 2,4-D.

 perbanyakan propagul berwujud  kalus 

pada kultur umbut kelapa sawit.  Tampak kalus yang terbentuk dari eksplan umbut kelapa sawit disubkultur ke media induksi kalus sehingga 

diperoleh lebih banyak kalus, dimana kalus-kalus itu  lalu  diinduksi menjadi tunas dengan melakukan sub kultur ke media induksi tunas. 

Tunas-tunas ini kembali diperbanyak lagi sehingga diperoleh lebih banyak tunas.  Tunas-tunas ini siap memasuki tahap /  berikutnya 

yaitu pengakaran. Skala = 1 cm. 

Tahap pengakaran yaitu  tahap dimana tunas-tunas yang sudah  tumbuh dipindahkan ke media induksi akar agar terbentuk tanaman . Pengakaran  dilakukan secara in-vitro  atau eks-vitro ,Induksi akar secara in-vitro dilakukan tetap di laboratorium dalam keadaan  aseptik.   Untuk menstimulasi pertumbuhan akar, pada media kultur ditambahkan ZPT dari golongan auksin.

Induksi akar secara eks-vitro dilakukan dengan cara melakukan transplanting tunas-tunas mini ke media semi steril di luar laboratorium. Pangkal-pangkal tunas ini biasanya dicelupkan dahulu ke larutan yang mengandung auksin untuk merangsang tumbuhnya akar sebelum 

 ditanam pada media semisteril yang sudah disiapkan. Pengakaran eks-vitro  lebih efisien sebab   in-vitro lebih  rumit ,tumbuhan  hasil kultur jaringan tidak dapat ditanam langsung  di kebun , sebab  memerlukan proses adaptasi bertahap terhadap lingkungan barunya  ,  sebab keadaan  lingkungan mikro botol kultur memicu  tumbuhan  hasil kultur jaringan tidak memiliki lapisan lilin dan stomata tidak berfungsi sehingga berisiko jika langsung ditanam di kebun . Aklimatisasi dalam kultur in-vitro yaitu   proses adaptasi dari tumbuhan  hasil kultur in-vitro (tanaman ) terhadap  lingkungan baru sebelum ditanam di kebun .  keadaan  lingkungan baru itu  antaralain kelembaban,suhu, cahaya ,  Kematian tanaman  sesudah  aklimatisasi kerap  terjadi sehingga tahap ini perlu dilakukan 

secara hati-hati.  Jika keadaan  suhu kultur 20oC, sedang   keadaan  kebun  35oC, maka suhu pada saat aklimatisasi ditingkatkan secara gradual diantara suhu itu .  contoh  aklimatisasi tahap 1, 

selama dua bulan pada suhu 25oC, lalu  masuk ke aklimatisasi tahap 2 yaitu selama 1 bulan pada suhu 32oC, baru lalu  dipindahkan ke keadaan  kebun .  juga untuk cahaya ditingkatkan secara 

gradual, sampai akhirnya tercapai cahaya penuh di kebun .  Perlakuan suhu dan cahaya saat aklimatisasi ini bisa dilakukan dengan pemberian 

atap paranet dengan tingkat pori-pori  paranet yang semakin renggang dari waktu ke waktu.  Untuk perlakuan cahaya bisa ditambahkan lampu.  sedang  untuk  kelembaban dengan 

menyemprotkan air dengan mist blower  mirip  kabut.   Kelembaban pada lingkungan mikro tumbuhan  kultur berkisar  80-90%, sedang  kelembaban lingkungan di kebun  yang panas terik 

sekitar 50-70%, Pada aklimatisasi tahap 2  tumbuhan  sudah ditransplanting ke  pot yang lebih besar ini lalu  dapat dipindahkan ke kebun .

 eksplan beregenerasi, mengalami morfogenesis dan tumbuh menjadi tanaman  dalam kultur jaringan melalui  organogenesis dan  embriogenesis 

Masing-masing terbagi lagi menjadi dua cara, yaitu  secara langsung dan secara tidak langsung (  kalus ),Embriogenesis somatik yaitu  proses terbentuknya struktur mirip  embrio dari sel-sel somatik.  tahap  embriogenesis somatik ini mirip   tahap  terbentuknya embrio zigotik hasil fertilisasi.  Embriogenesis somatik terbentuk dari masing-masing sel ,lalu  memasuki tahap   bentuk bundar, tahap  bentuk hati  dan tahap  bentuk mirip  torpedo  lalu  menjadi embrio.  Pada tahap  

torpedo, meristem ujung batang dan meristem ujung akar sudah dapat terdeteksi.  Meristem ujung batang nantinya akan berkembang menjadi 

tunas dan meristem ujung akar menjadi akar.  Proses terbentuknya  embrio somatik ini dapat terjadi secara langsung maupun tidak langsung 

(melalui kalus).  Pada  embriogenesis somatik secara tidak langsung, contoh  tumbuhan  wortel 

(Daucus carota).  Eksplan yang berasal dari jaringan pada umbi wortel (contoh  empulur) disterilisasi dan ditanam pada media dasar MS padat yang mengandung 1mg/liter 2,4-D untuk menginduksi kalus.  Kalus yang terbentuk lalu  disubkultur ke media MS cair tanpa hormon 

untuk menginduksi sel-sel (massa sel) yang embriogenik (sel-sel yang berpotensi  membentuk embrio) yang lalu  membentuk embrio somatik. Kultur sel dalam media cair ini dilakukan dengan 

 penggoyangan.  lalu  embrio somatik ini disubkultur ke media MS padat yang mengandung 0,025 mg/liter ABA (absicic acid) untuk pematangan embrio (membentuk mature embryos).  Dari embrio ini lalu  terbentuk tanaman .

Contoh lain dari embriogenesis somatik secara tidak langsung (melalui kalus)  pada tumbuhan  

anggrek Coelogyne cristata.  Kalus diinduksi dari irisan daun (panjang 3-5 mm) yang berasal dari perkecambahan dalam botol dengan cara menanam 

pada media MS (konsentrasi penuh) yang ditambah hormon 2,4-D dan Benzyladenine (BA).  Konsentrasi 2 mgL-1 2,4-D dan 2 mgL-1 

BA memberi  hasil optimal untuk pembentukan kalus.  lalu  kalus itu  disubkultur pada media ½ MS tanpa hormon dengan penambahan 2gL-1 arang aktif untuk pembentukan embrio somatik. 

lalu  terjadi pematangan embrio dan membentuk tumbuhan  secara utuh (tanaman ) sesudah  30 hari subkultur.Embriogenesis secara langsung jarang dilakukan dalam perbanyakan tumbuhan  melalui kultur jaringan dibandingkan   secara langsung.  Contoh  untuk tumbuhan  alfalfa (Medicago falcata).  Eksplan yang berwujud  daun trifoliate muda disterilisasi dan diiris menjadi potongan-potongan kecil dan diletakkan lpada media dasar B5 cair yang mengandung glutathione (10 mg/liter) 2,4-D (4 mg/liter), kinetin (0,2 mg/liter), adenin (1 mg/liter),  dan dishaker selama 10-15 hari.  lalu  eksplan dicuci bersih dan dipindah ke 

media B5 cair tanpa hormon yang mengandung polyethylene glycol dan maltose untuk pembentukan embrio somatik.  Pematangan embrio dilakukan dengan melakukan subkultur ke media dasar B5 padat yang  mengandung ABA.  lalu  embrio ini membentuk tanaman .Jika dilihat dari proses pembentukan embrio somatik, baik secara langsung maupun tidak langsung, sebetulnya melewati dua tahap  yang sama.  tahap  pertama yaitu  pemakaian  2,4-D konsentrasi tinggi untuk inisiasi embrio dan tahap  kedua yaitu  tanpa 2,4-D untuk produksi embrio. 

Jadi disini ditekankan bahwa untuk terbentuknya embrio somatik, media harus bebas dari 2,4-D sebab  2,4-D menginduksi sel-sel untuk terus 

menerus berada pada tahap  tidak terdiferensiasi ,

sehingga embrio tidak terbentuk.  Pemindahan ke media tanpa hormon  diperlukan untuk terjadinya diferensiasi sel menjadi embrio. 

Organogenesis dalam kultur jaringan  dalam proses terbentuknya organ dari jaringan eksplan secara langsung, maupun  tidak langsung (melalui tahap  kalus).   regenerasi tumbuhan  

melalui organogenesis dibedakan menjadi 3 tipe, yaitu: - Organogenesis secara tidak langsung melalui tahap  kalus,

- Organogenesis secara langsung dari eksplan yang memiliki primordia tunas,

- Organogenesis secara langsung dari eksplan yang tidak memiliki primordia tunas,

Organogenesis secara langsung dari eksplan yang memiliki primordia tunas dapat terjadi jika jaringan eksplan yang dipakai  memiliki bakal tunas yang belum muncul ke permukaan.  Tunas apikal , tunas lateral dan irisan buku/ruas pada batang  dapat dijadikan bahan eksplan untuk pilihan tipe ini.  Media kultur direkayasa dengan 

menambahkan hormon untuk induksi tunas sehingga bakal tunas itu  dapat muncul ke permukaan.  Adanya hormon jenis sitokinin 

dapat memunculkan tunas-tunas itu , tidak hanya satu tunas namun terjadi proliferasi sehingga muncul tunas dalam jumlah banyak.  Tunas 

yang muncul dari prinsip  mikropropagasi dengan cara ini dinamakan  tunas aksilar, dinamakan  axillary bud formation (abf).  Khusus untuk anggrek dari genus Phalaenopsis, ruas tangkai 

bunganya berisi bakal tunas sehingga kerap  dipakai  untuk bahan eksplan dalam mikropropagasi dengan prinsip  abf. 

Organogenesis secara langsung dari eksplan yang tidak memiliki bakal tunas dapat terjadi jika tunas muncul secara langsung contoh  dari irisan daun.  , tunas  kecil dapat tumbuh secara langsung 

dari irisan daun anggrek Vanda tricolor yang ditanam pada media dasar MS tanpa hormon ,  lalu  tunas ini disubkultur ke media untuk induksi akar untuk menghasilkan tanaman .  Tunas yang 

muncul dari jaringan tumbuhan  yang tidak memiliki bakal tunas dinamakan  tunas adventif.   tunas adventif juga dipakai  untuk perbanyakan 

tumbuhan  secara vegetatif konvensional, contoh  untuk tunas yang muncul dari stek daun tumbuhan  cocor bebek (Coleus sp).

Organogenesis secara tidak langsung terjadi jika organ yang terbentuk  dalam hal  ini  tunas terjadi melalui tahap  kalus.  Contohnya   pada kultur umbut kelapa sawit ,  Kalus yang awalnya terbentuk dari eksplan umbut kelapa sawit disubkultur ke media yang mengandung 

hormon untuk induksi tunas.  lalu  tunas-tunas ini dipindahkan ke media pengakaran untuk membentuk tanaman  secara utuh.

Bodies pada tumbuhan  Anggrek Protocorm yaitu   struktur berbentuk bulat, berwarna  hijau kekuningan yang dihasilkan dari perkecambahan biji-biji anggrek.  biji anggrek berjumlah jutaan dalam sebuah kapsul ( buah anggrek), jika berkecambah membentuk struktur bulat berwarna putih pada awalnya.  Lama kelamaan struktur putih  akan berubah menjadi kuning, lalu  hijau kekuningan dan hijau. Protocorm memiliki bakal akar dan bakal tunas seperti halnya embrio 

zigotik sebab  protocorm berasal dari biji.  Pada anggrek V. tricolor, meristem ujung batang akan terdeteksi 12 minggu sesudah  penanaman. 

Protocorm like bodies (plb) yaitu  struktur mirip  protocorm  yaitu  hasil morfogenesis dari eksplan yang berasal dari sel-sel somatik. contoh  jika bahan eksplan yaitu  organ tumbuhan  anggrek, 

seperti irisan daun atau irisan akar.  Plb juga memiliki bakal akar dan bakal tunas seperti protocorm, sehingga plb sebetulnya mirip  

embrio somatik. plb usia  6 MST yang sudah 

menampakkan bakal tunas.  Akar terbentuk dengan sendirinya tanpa melalui pemindahan ke media pengakaran, menunjukan bahwa plb  memiliki bakal akar seperti  protocorm dari biji. maka , plb yang terbentuk dari sel-sel somatik itu  

lebih mirip  embrio somatik, sehingga prosesnya lebih kepada embriogenesis dibandingkan organogenesis.  Jadi plb bersifat bipolar, 

artinya memiliki bakal tunas dan sekaligus bakal akar. Sifat bipolar dan monopolar yaitu  perbedaan yang paling mendasar antara embriogenesis dan organogenesis ,  Organogenesis dicirikan oleh sifat monopolar, atau pertumbuhan ke satu arah yaitu  

pembentukan dan pertumbuhan tunas (ke arah atas) atau pembentukan dan pertumbuhan akar (ke arah bawah), sedang  pada embriogenesis 

pertumbuhan terjadi ke dua arah.  Pada organogenesis, pertumbuhan yang terjadi masih berhubungan  dengan jaringan eksplan asalnya, sedang  pada embriogenesis pertumbuhan yang terjadi bersifat mandiri dan tidak berhubungan lagi dengan jaringan eksplan asalnya.berdasar dari bahan eksplan yang dipakai , kultur jaringan tumbuhan  dibedakan menjadi :

- Kultur anther/mikrospora (Anthere/microspore cultures)

- Kultur kalus dan kultur sel (callus cultures and cell cultures)

- Kultur biji (seed cultures),

- Kultur meristem(meristem cultures)

- Kultur ujung tunas (shoot-tip cultures)

- Kultur embrio (Embrio cultures)

- Kultur dan Fusi protoplas (Protoplast cultures)

- Kultur meristem (meristem cultures) yaitu  bagian tananaman yang sel-selnya bersifat 

meristematik dan aktif membelah.  Pada tubuh tumbuhan  posisi meristem ada pada ujung tunas (tunas apikal maupun aksilar) yang berfungsi 

menambah panjang tunas, pada ujung akar berfungsi menambah panjang akar dan  pada kambium batang yang memicu  bertambah besarnya diameter tumbuhan . Pada tumbuhan  suku graminae (rumput-rumputan) ada  meristem khusus yang dinamakan  meristem interkalar yang posisinya ada pada buku batang yang memicu  bertambah panjangnya ruas  batang.

Dalam kultur jaringan, meristem yang biasa  dipakai  sebagai bahan eksplan yaitu  meristem ujung tunas (apikal maupun aksilar). Kultur meristem memakai  bahan eksplan yang sangat kecil, berukuran ≤ 1 mm.  Eksplan meristem harus diambil memakai  mikroskop dalam laminar.  Irisan meristem terdiri dari apical dome 

(ujung tunas yang posisinya paling atas) dan  dua primordia daun yang terkecil tanpa menyertakan jaringan pembuluh.Kultur meristem menghasilkan progeni (anakan) tumbuhan  yang bebas virus walau bahan eksplan berasal dari tumbuhan  yang terserang virus.  yang  memicu  dihasilkannya tumbuhan  bebas virus dari kultur meristem yaitu :

- Aktifitas metabolit yang  tinggi pada sel-sel meristem yang aktif membelah sehingga tidak memungkinkan virus bereplikasi.Tingginya kandungan auksin endogen pada meristem mungkin menghambat replikasi virus.  

- Sistem jaringan pembuluh belum berkembang pada meristem, sedang virus bergerak dalam tubuh tumbuhan  melalui jaringan pembuluh.

Kultur meristem yaitu  sistem organogenesis secara langsung, sehingga memungkinkan diperoleh anakan yang lebih stabil jika dibandingkan melalui tahap  kalus.  Produksi tumbuhan  bebas virus dengan keadaan  genetis yang stabil melalui kultur meristem sudah dilakukan  untuk tumbuhan  apel,kentang, tebu, pisang ,Makin besar ukuran eksplan makin mempermudah proses kultur dan memicu  lebih banyak tanaman  yang dihasilkan,  namun  

diperoleh anakan tumbuhan  yang bebas virus makin sedikit ,Ukuran eksplan yang semakin besar  memicu  eksplan lebih kuat dalam proses sterilisasi sehingga memungkinkan persentase 

eksplan bertahan hidup sesudah sterilisasi lebih besar dan diperoleh jumlah tanaman  yang lebih banyak.   semakin besar ukuran eksplan memicu  keikutsertaan jaringan pembuluh pada eksplan 

yang dipakai  sehingga kemungkinan adanya virus pada tanaman  yang dihasilkan akan menjadi lebih besar.  Jika tujuan dari perbanyakan melalui kultur jaringan bukan untuk tujuan dihasilkannya tumbuhan  bebas virus, maka lebih baik dipakai  kultur ujung tunas yang memakai  ukuran eksplan lebih besar sebab  pengerjaannya menjadi lebih mudah. 

Kultur ujung tunas memakai  eksplan bakal tunas aksilar atau apikal ,  berukuran 3-20 mm, menyertakan  primordia daun dan jaringan pembuluh. Eksplan bakal tunas aksilar dapat berwujud  irisan buku  sebab  pada irisan buku (buku yaitu  bekas tempat daun tumbuh) ada  bakal tunas aksilar.  Eksplan ditanam pada media induksi tunas (media dengan kandungan sitokinin) 

untuk memunculkan pre-existing tunas yang ada dalam eksplan.Tunas dalam jumlah banyak bisa muncul ,namun bisa juga hanya dihasilkannya satu tunas dari satu eksplan.  Jika  dihasilkan banyak tunas, tunas-tunas itu  disubkultur ke media perakaran (media dengan auksin) untuk dihasilkannya tanaman .  Namun jika yang muncul hanya satu tunas, maka dilakukan kultur  nodal segment kembali dari satu tunas yang dihasilkan itu .  Caranya  dengan  menanam kembali irisan buku yang dihasilkan oleh tunas itu .  Penanaman nodal segment dilakukan dengan posisi irisan buku tidur.  Tunas yang muncul lalu  bisa disubkultur ke media perakaran untuk dihasilkannya tanaman .  Proses ini bisa diulang 

kembali untuk diperoleh lebih banyak tanaman .  Munculnya bakal tunas aksilar sebagai bahan eksplan pada tumbuhan  induk dapat dilakukan 

dengan menstimulasinya.  Contohnya pada tumbuhan  Aglaonema sp. Buku (node) pada batang disuntik dengan 30 μl BAP (konsentrasi 

30 ppm) untuk memunculkan benjolan yang berwujud  bakal tunas aksilar ,  Bakal tunas aksilar ini lalu  diambil untuk dijadikan bahan eksplan.  Perlakuan ini mempercepat pertumbuhan  tunas aksilar secara in vitro dibandingkan dengan menanam irisan buku 

secara in vitro tanpa perlakuan.Perbanyakan tumbuhan  dengan kultur ujung tunas ini sukses 

dilakukan untuk tumbuhan  pisang.  prinsip  ini dinamakan superior (dibandingkan perbanyakan pisang secara konvensional dengan sucker) 

dalam hal hasil  yang diperoleh,  kebersihan bibit sebab  bebas penyakit ,keseragaman bibit dan  sifat yang diturunkan ,

 kultur embrio yaitu  mengkulturkan embrio zigotik secara in vitro.  Embrio zigotik yaitu  hasil fertilisasi antara  inti sel sperma dan  sel telur  yang terjadi pada proses fertilisasi ganda tumbuhan  angiospermae.  Embrio zigotik dapat dipakai  sebagai bahan eksplan namun 

untuk keadaan  tertentu seperti:

- Embrio hasil fertilisasi tidak berkembang dan mati.  Contohnya   embryo rescue pada embrio zigotik hasil persilangan  buatan yang dilakukan para pemulia tumbuhan  jeruk keprok. sesudah  melakukan persilangan buatan, embrio muda diambil dari tumbuhan  induk dan ditumbuhkan secara in vitro sebab  pada tumbuhan  induknya embrio itu  tidak berkembang dan mati,

- Embrio tidak bisa ditumbuhkan dalam keadaan  biasa secara eks vitro sebab  tidak memiliki cadangan makanan. contoh  pada tumbuhan  anggrek.  Biji-biji anggrek yang berukuran sangat 

kecil dan berjumlah sangat banyak mencapai ribuan dari sebuah kapsul tidak memiliki endosperm (cadangan makanan) yang diperlukan oleh biji untuk perkecambahan.  Biji-biji ini harus ditumbuhkan secara in vitro dengan memberi nutrisi buatan untuk dapat berkecambah ,

Kultur dan fusi protoplas  mengacu pada sel tumbuhan  tanpa dinding sel atau isi sel yang terbungkus hanya oleh membran plasma.  Protoplas dari sebuah sel dapat dipisahkan dari dinding selnya secara enzimatik maupun  mekanik.  Protoplas yang sudah terpisah dari dinding 

selnya ini dapat diregenerasikan menjadi tumbuhan  secara utuh. regenerasi protoplas menjadi tumbuhan  secara utuh pertama dilakukan pada protoplas daun tembakau 

melalui kultur protoplas yang dilakukan oleh Takebe pada tahun 1970,Isolasi protoplas secara enzimatik pertama kali dilakukan oleh  E.C. Cocking awal tahun 1960,Isolasi protoplas dan kultur protoplas menjadi dasar dilakukannya 

fusi protoplas atau hibridisasi in vitro dari dua tertua  tumbuhan  dengan sifat-sifat yang unggul.  Fusi protoplas atau hibridisasi in-vitro ini 

dilakukan sebab  adanya  ketidakcocokan  yang 

terjadi pada persilangan buatan yang dilakukan secara konvensional di kebun  sehingga gagal terbentuk embrio.  Hasil fusi protoplas ini 

bisa ditumbuhkan menjadi tumbuhan  secara utuh yang membawa sifat  dari dua tertua  dari mana protoplas itu  berasal.  Fusi protoplas ini 

 memungkinkan dilakukannya persilangan antar dua tumbuhan  yang berhubungan  kekerabatan yang jauh, dimana  persilangan itu  sulit dilakukan.

prinsip  isolasi protoplas yang biasa  dilakukan yaitu  secara enzimatik/ mekaniju, Secara 

enzimatik, dinding sel dapat didegradasi dan dihilangkan  dengan memakai  enzim selulase dan pektinase sebab  materi  utama dari dinding sel tumbuhan  yaitu  senyawa selulosa dan pektin.  Reagen atau larutan untuk mengisolasi protoplas,  mengandung enzim selulase , pektinase dan  larutan osmotik untuk menjaga stabilitas dari membran plasma  agar terhindar dari kerusakan.  Gula dan garam seperti CaCl2 dapat dipakai  

sebagai larutan osmotik. pH reagen ,Bahan tumbuhan , jenis enzim yang dipakai  untuk 

isolasi protoplas  berpengaruh terhadap jumlah protoplas yang diperoleh dalam proses isolasi itu .   spesies tumbuhan   berpengaruh terhadap reagen yang diperlukan .   jaringan daun yang ditumbuhkan secara in vitro  pada tumbuhan  Jatropa curcas L. dan Ricinus communis L. 

menghasilkan jumlah proptoplas terisolasi lebih banyak dibandingkan jika memakai  kalus in vitro.  

untuk R.communis L. jumlah protoplas terbanyak diperoleh dari pemakaian  campuran  enzim 

CaCL22H2O , MES buffer (pH 5),cellulose Onuzuka R10, pectinase, mannitol, 

untuk J. curcas L. protoplas terbanyak diperoleh 

pada pemakaian  reagen berwujud  campuran enzim 2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES) buffer (pH 5,6), cellulose Onuzuka R10, 

pectolyase Y23, mannitol, CaCL22H2O , 

Sebelum dilakukan fusi protoplas, hasil isolasi protoplas lalu  dipurifikasi untuk memisahkannya dari kotoran sel , sisa sisa enzim , dari protoplas yang rusak.  cara nya yaitu : Untuk memisahkan kotoran sel dipakai  saringan yang terbuat dari steel atau nilon berukuran mesh  100μ pore, sedang  untuk memisahkan dari sisa sisa 

enzim dilakukan sentrifugasi 600 rpm selama 5 menit.  Protoplas akan berada di dasar tabung, supernatan yang berisi enzim dibuang dengan 

pipet.  lalu  protoplas dicuci untuk memisahkannya dari sisa-sisa enzim dengan larutan pencuci yang terdiri dari larutan osmotik dan nutrisi.  Caranya diresuspensi lalu  disentrifugasi kembali.  ini  dilakukan 2 hingga 3 kali.  Protoplas utuh dipisahkan dari protoplas rusak dengan cara menambahkan larutan sukrosa 20-40%, disentrifugasi 350 rpm selama 5 menit.  Protoplas utuh akan berada di bagian atas larutan 

sukrosa dan lalu  dipipet dengan hati-hati.  lalu  protoplas yang murni lalu  diuji daya viabilitasnya.

Fusi protoplas dilakukan sesudah  diperoleh protoplas yang murni , Terjadinya fusi protoplas memerlukan keadaan  ion Ca++ yang tinggi dan pH larutan yang tinggi.  Pengerjaan isolasi, 

pemurnian dan fusi protoplas semua dilakukan dalam keadaan  aseptik.

kultur Mikrospora yaitu  sel kelamin (gamet) jantan pada tumbuhan   angiospermae dan  ditemukan pada bunga tumbuhan  yang masih 

kuncup.  Mikrospora dapat dikatakan sebagai immature pollen (polen yang belum masak fisiologi ).  Secara alamiah, mikrospora akan 

berkembang menjadi polen atau serbuk sari.   Polen ini nantinya akan berkembang menjadi inti sperma 1 dan inti sperma 2 pada penyerbukan 

ganda tumbuhan  angiospermae.  Namun pada kultur mikrospora, mikrospora dibelokkan arah perkembangannya menjadi embrio, bukan 

menjadi polen.  Embriogenesis mikrospora atau androgenesis ini akan menghasilkan tanaman  (tumbuhan ) yang bersifat haploid atau 

double haploid (DH) , Dihasilkannya tumbuhan  

DH melalui kultur spora yaitu  teknik   pemuliaan 

tumbuhan  dan juga  riset-riset dasar.  Dihasilkannya tumbuhan  DH ini akan mempersingkat waktu yang diperlukan  oleh pemulia tumbuhan  secara konvensional untuk menghasilkan tumbuhan  homozigot.  Namun  

kultur mikrospora juga memiliki kekurangan yaitu  kerap  terjadinya albinisme pada tanaman  yang dihasilkan.Mikrospora dan anther (wadah mikrospora), keduanya dapat dipakai  sebagai bahan eksplan, namun lebih baik dipakai  

mikrospora yang sudah diisolasi dari anther 

Jaringan anther dapat memberi  dampak negatif dan bisa menjadi kalus diploid yang nantinya berkembang menjadi tumbuhan  diploid yang tidak homozigot atau heterozigot, sedang  jika murni mikrospora maka akan dihasilkan  tumbuhan  haploid.  lalu  melalui teknik doubling chromosome  akan dihasilkan tumbuhan  DH yang homozigot. banyak variasi  teknik mikrospora   Namun pada dasarnya, teknik itu   memiliki cara  yaitu:   Menumbuhkan mikrospora menjadi embrio (induksi embriogenesis) Melakukan doubling chromosome jika diperlukan. Menumbuhkan tumbuhan  donor/tumbuhan  induk penghasil mikrospora,Panen organ bunga yang masih kuncup, Isolasi mikrospora, Embriogenesis mikrospora memerlukan perlakuan stress untuk menginduksi terbentuknya embrio dari mikrospora.  Perlakuan itu  dapat berwujud  perlakuan secara in vivo maupun in vitro , Perlakuan secara in vitro 

contoh  keadaan  anaerob, radiasi , perlakuan senyawa kimia dapat menjadi stimulus untuk terbentuknya embrio dari mikrospora. Secara in vivo contoh , perlakuan stress terhadap tumbuhan  donor berwujud  kekurangan nitrogen, kekurangan air dan perlakuan suhu  rendah dapat meningkatkan jumlah embrio yang dihasilkan dari kultur mikrospora.  Semua perlakuan stress itu  dapat merubah   program perkembangan mikrospora yang seharusnya menjadi polen untuk 

menjadi embrio.Kultur Kalus dan Kultur Suspensi  yaitu  kumpulan sel yang belum terdiferensiasi.  Kalus terbentuk pada bekas luka atau irisan pada organ tumbuhan .  Secara in vitro kalus akan terbentuk pada bagian irisan dari organ yang dikulturkan, namun pada beberapa spesies tumbuhan , kalus dapat terbentuk pada bagian sebelah dalam ,semua organ jaringan tumbuhan  yang sel-selnya masih hidup dapat membentuk kalus secara in vitro.  namun jaringan tumbuhan  yang masih muda (belum ada lignifikansi pada dinding selnya), atau jaringan muda yang bersifat meristematik akan lebih mudah menghasilkan kalus.  perkecambahan (kecambah) yang dibuat 

secara in vitro dari biji (yang sudah disterilkan) sangat baik dipakai  sebagai bahan eksplan untuk pembuatan kalus.  Kalus akan terbentuk 

jika eksplan ditanam pada media kultur yang mengandung auksin dan sitokinin dengan rasio yang sama atau media yang mengandung 2,4-D.

Kalus yaitu  bentuk antara sebelum terbentuknya embrio dalam proses indirect embriogenesis somatik maupun sebelum terbentuknya organ pada indirect organogenesis.  Kalus juga yaitu  

bahan stock untuk kultur suspensi.Pada kultur suspensi, kalus yang terbentuk akan diambil dan 

dikulturkan pada media cair membentuk kultur cair atau kultur suspensi. Kalus yang remah dengan mudah lepas membentuk kultur sel.  Kultur sel dilakukan dengan agitasi atau shaker (penggoyangan) untuk suplai oksigen.  Pada perbanyakan tumbuhan  melalui kultur in-vitro, kultur sel (melalui kalus) dipakai  dalam embriogenesis secara tidak langsung , namun  

anakan yang dihasilkan melalui kultur sel secara genetik bersifat tidak stabil sehingga prinsip  ini jarang dipakai .  Kultur sel biasanya dibuat 

untuk produksi senyawa kimia tertentu, untuk riset-riset yang terkait dengan investigasi jalur biosintesis senyawa tertentu atau  riset yang 

terkait dengan fisiologi  sel.Kultur biji dilakukan untuk biji tumbuhan  yang tidak dapat dikecambahkan secara eks vitro atau  kalau dapat berkecambah secara eks vitro maka persentase perkecambahannya sangat rendah. sebab  biji-biji itu  berukuran sangat kecil dan sedikit atau tidak sama sekali memiliki endosperm (cadangan makanan).   kultur biji tanpa cadangan makanan ini  dinamakan  kultur embrio.  Cadangan makanan pada biji diperlukan oleh embrio biji untuk proses respirasi sehingga menghasilkan energi untuk berkecambah.  Alasan ini memicu  biji-biji tumbuhan  ini harus dikecambahkan secara in vitro dengan memberi  sumber karbohidrat eksternal untuk respirasi.  Selain itu,  pada media juga ditambahkan nutrisi untuk pertumbuhan lanjutan dari biji yang sudah berkecambah.   contoh  biji tumbuhan  anggrek.

Buah anggrek biasanya berbentuk kapsul.  Di dalam satu buah anggrek ada   jutaan biji anggrek.  Biji anggrek ini dikecambahkan secara in vitro pada media kultur yang aseptik. Kandungan nutrisi pada media sama dengan media kultur biasanya, namun pada media kultur biji anggrek biasanya ditambahkan senyawa organik alami seperti ekstrak tomat, air kelapa,  pisang,  kentang, 

Perkecambahan biji anggrek tergantung dari usia  buah, kultivar (atau takson yang lebih rendah, forma),   jenis dan konsentrasi senyawa ekstrak alami yang ditambahkan.  bahwa pada media kultur NP (New Phalaenopsis) yang diperkaya 

dengan ekstrak tomat, biji-biji anggrek Vanda tricolor dari buah usia  5 bulan (sesudah  polinasi) memberi  lebih banyak jumlah protokorm 

berwarna dibandingkan buah usia  7 bulan.   bahwa perkecambahan dan  pertumbuhan biji V. tricolor var. suavis forma Bali (tumbuh alami ) lebih responsif terhadap pemberian ekstrak 

tomat dibandingkan tumbuh alami di lereng Merapi,senyawa  organik alami berwujud  ekstrak tomat memberi  pertumbuhan yang lebih baik untuk perkecambahan dan pertumbuhan lanjutan biji anggrek 

V. tricolor  dibandingkan dengan air kelapa,  konsentrasi 100-200 gram ekstrak tomat per liter media memberi  hasil optimal untuk pertumbuhan protokorm V. tricolor. cara menanam biji anggrek yaitu  . Buah anggrek dicuci bersih, disikat dengan detergen dan dibilas dengan air kran hingga bersih.  lalu  buah anggrek itu  dicelup ke dalam spiritus dan diekspose ke arah api, diulang hingga tiga kali, lalu  dimasukkan ke dalam laminar.  Di dalam laminar, buah itu  kembali diekspose ke arah api satu kali, lalu  diletakkan pada cawan petri steril.  Buah ini dibelah dengan pisau steril dan bijinya 

ditabur pada media steril yang sudah disiapkan.  Proses penaburan biji anggrek ini semua berlangsung dalam laminar.Biji anggrek yang berkecambah akan membentuk protokorm. 

Protokorm ini berkembang menjadi tanaman .  Prosedur penanaman biji anggrek ini yaitu  prosedur dalam pembuatan bibit anggrek botol. 

tanaman  yang sudah memiliki 3 atau 4 daun dan memiliki akar yang kuat sudah siap diaklimatisasi (dikeluarkan dari botol) untuk ditanam dalam comonity pot (compot), dimana dalam satu pot ada 10-20 tanaman , tergantung ukuran potnya.  Jika tumbuhan  sudah mencapai kurang lebih 

tinggi 5 cm, tumbuhan  anggrek dapat dipindah ke masing-masing pot (1 pot untuk 1 tumbuhan ).

Variasi somaklonal sebagai variasi genetik dan/atau fenotip yang terjadi diantara populasi tumbuhan  yang diperbanyak secara vegetatif dari satu tumbuhan  donor/tumbuhan  induk ,Variasi somaklonal dapat diinduksi oleh proses in-vitro atau oleh lingkungan in-vitro.  Variasi somaklonal dapat bersifat genetik atau  epigenetik. Variasi somaklonal yang bersifat genetik contoh terjadinya perubahan pada urutan (sekuens) basa-basa DNA . mutasi gen (transisi, transversi, insersi, dilesi) , perubahan jumlah kromosom (poliploidi, euploidi), perubahan struktur kromosom 

(translokasi, inversi, duplikasi), Variasi somaklonal yang bersifat genetik bersifat diturunkan (heritable) pada regenerasi berikutnya.  Variasi somaklonal yang bersifat epigenetik 

lebih dipicu  oleh oleh faktor lingkungan yang mempengaruhi ekspresi gen.  Kemungkinan bisa terjadi gene silencing (gen off) atau gene activation (gen on) dan tidak melibatkan perubahan pada struktur atau  sekuens DNA .  Variasi somaklonal yang bersifat epigenetik 

ini bersifat tidak permanen atau dapat balik (reversible) dan tidak diturunkan pada generasi berikutnya , Perubahan faktor lingkungan akan memicu  perubahan pada aktivasi/non-

aktivasi gen tertentu yang memicu  adanya perubahan fenotip. Deteksi variasi somaklonal pada hasil perbanyakan melalui kultur  in-vitro (contoh  kultur organ) dapat dideteksi sejak dini secara genetik melalui Random Amplifi ed Polymorphism DNA (RAPD). RAPD memakai  beberapa primer non-khusus  yang mengamplifi kasi  sepenggal DNA secara random dari DNA genom tumbuhan .  Hasil  amplifikasi menghasilkan data biner yang nantinya dengan suatu  program (contoh  NTSYSpc Version 2.10q) akan menghasilkan suatu  dendrogram dengan similarity coeffi cient yang menunjukkan adanya 

kesamaan/perbedaan secara genetik.  Semakin tinggi koefisien, jarak  dalam dendrogram akan semakin jauh, menunjukkan adanya perbedaan 

secara genetis antar dua masing-masing itu  semakin besar.   hasil perbanyakan tumbuhan  secara kultur in-vitro akan bersifat seragam secara genetik.  Namun  variasi genetik terjadi 

pada populasi tumbuhan  yang diperoleh dari kultur organ dari satu donor  tumbuhan .  Diperlukan riset  untuk mengidentifikasi tentang 

variasi genetik ini. Variasi somaklonal  terdeteksi secara fenotipik pada tumbuhan  kelapa sawit yang diperbanyak melalui jalur organogenesis secara tidak  langsung atau melalui tahap  kalus  Kalus  sebagai bentuk  antara dalam organogenesis secara tidak langsung dan  subkultur yang dilakukan secara berulang  sebagai penyebab terjadinya ketidaknormalan pada daun kelapa sawit ini.Variasi somaklonal tidak selalu bersifat buruk.  kadang 

tumbuhan  yang memiliki sifat  unggul muncul secara tidak sengaja pada perbanyakan in-vitro.  ini  yaitu  salah satu  keuntungan dari adanya variasi somaklonal, namun tidak  untuk perbanyakan tumbuhan  yang bertujuan menghasilkan klon yang seragam, maka munculnya variasi somaklonal ini tidak diharapkan.

 

 permasalahan l pada kultur tumbuhan  secara in-vitro  yaitu:

Kontaminasi oleh mikroorganisme yaitu  permasalahan  kultur jaringan dan memicu  kegagalan, sehingga keadaan  aseptik /  persyaratan dalam  kultur in-vitro.  ini  dipicu   media kultur mengandung gula dan nutrisi lainnya yang tujuannya untuk pertumbuhan eksplan, namun disisi lain ini  bisa dimanfaatkan oleh 

mikroorganisme sebagai sumber makanan untuk pertumbuhannya. Mikroorganisme yang biasanya menjadi sumber kontaminan pada kultur jaringan yaitu  fungi/bakteri ,Sumber kontaminasi  berasal dari jaringan eksplan maupun  dari luar jaringan eksplan.  Secara internal  bisa dipicu  oleh prosedur sterilisasi permukaan  eksplan yang kurang sempurna sehingga eksplan tidak  bebas dari mikroorganisme. Mikroorganisme itu  lalu  tumbuh saat  eksplan ditanam pada media kultur.  

ini  memerlukan trial dan error sebab  berbeda untuk jenis spesies dan macam bahan eksplan yang dipakai .  Sterilan tidak hanya dapat 

membasmi mikroorganisme, namun konsentrasi yang terlalu tinggi dapat membasmi jaringan eksplan.  Sebaliknya jika konsentrasi terlalu 

rendah maka proses sterilisasi tidak efektif.

Kontaminan internal juga dapat bersifat endogenous, berada di dalam jaringan eksplan sehingga tidak dapat dihilangkan hanya 

dengan sterilisasi permukaan.  pemakaian  tumbuhan  donor yang sehat, pemeliharaan tumbuhan  donor dalam rumah kaca dengan perlakuan penyemprotan pestisida dapat mencegah kontaminan endogen dari jaringan eksplan.   perendaman eksplan pada larutan antibiotik dapat menghambat pertumbuhan bakteri endogen. Sumber kontaminan eksternal  berasal dari media kultur, meja kerja   pekerja ,Proses sterilisasi media yang kurang sempurna memicu  adanya bibit  mikroorganisme spora jamur dalam media kultur  , Media kultur sebaiknya dipakai  minimal 1 minggu  sesudah  dibuat untuk memberi  peluang tumbuhnya bibit-bibit mikroorganisme ,Sterilisasi meja kerja (laminar) dengan penyemprotan alkohol dan pemakaian   UV diperlukan untuk meminimalisir sumber kontaminan eksternal.  pemakaian  masker dan sarung tangan oleh pekerja; 

membakar (pada api lampu bunsen) bibir botol kultur sebelum dan sesudah  eksplan ditanam,

penyemprotan tangan dengan alkohol sebelum pekerjaaan dimulai; mencelupkan dan membakar dissecting kit sebelum dipakai  untuk mengiris eksplan dalam laminar; 

 Pencoklatan (browning) yang terjadi pada media kultur  memicu  kematian jaringan eksplan.  Browning di sebabkan oleh eksudasi senyawa fenolik dari jaringan eksplan.  Senyawa fenolik yaitu  senyawa metabolit sekunder terbanyak yang ada  pada jaringan tumbuhan .  Senyawa 

fenolik itu  tereksudasi dari jaringan tumbuhan  akibat luka irisan baik saat  eksplan diambil dari tumbuhan  donor maupun saat  preparasi 

jaringan eksplan.Eksudasi senyawa fenolik ini memicu  aktifasi enzim Polyphenol oxidase (P PO)  yaitu  enzim oksidatif sehingga terjadi oksidasi senyawa fenolik yang memicu  kematian jaringan eksplan.  Oksidasi senyawa fenolik  ini menghasilkan senyawa kuinon yang   beracun bagi tumbuhan  sehingga memicu  sel-sel tumbuhan  mengalami nekrosis /mati ,

Selain enzim PPO, enzim oksidatif lainnya yaitu  enzim Phenylalanine ammonia lyase (PAL) , enzim peroxidase (POD), kedua enzim ini   katalisator untuk biosintesis polifenol 

 bahwa PPO dan POD bekerja secara kolektif 

dalam oksidasi senyawa fenolik,  PPO  menstimulasi POD dalam oksidasi senyawa fenolik. pencegahan browning dilakukan  dengan  pemakaian  antioksidan seperti ascorbic 

acid (asam askorbat) atau citric acid (asam sitrat); kultur dalam gelap; sub-kultur 2-3 kali dalam periode yang singkat.  pemakaian  arang aktif (activated charcoal); pemakaian  polyvinylpyrrolidone (PVP);

 cara mengatasi browning  tergantung pada spesies tumbuhan  dan   eksplan yang dipakai .

biasanya pemakaian  arang aktif dilakukan dengan menambahkan  2-3 gram per liter pada media kultur, namun pada spesies tertentu pemakaian  arang aktif sebanyak 10 gram per 

liter baru memberi  hasil dalam mengatasi browning.  Arang aktif menyerap senyawa fenolik yang tereksudasi dari jaringan eksplan 

sehingga browning pada media dapat dicegah.  Arang aktif  memiliki efek lain pada kultur, yaitu  merangsang pertumbuhan akar. PVP mencegah browning dengan menyerap senyawa fenolik 

yang tereksudasi dari jaringan eksplan melalui ikatan hydrogen, mencegah terjadinya oksidasi dan polimerisasi.  PVP juga berkombinasi 

dengan fenolik yang sudah teroksidasi dan mencegah oksidasi lanjutan. pemakaian  PVP  dilakukan dengan  cara, yaitu   perlakuan pada eksplan maupun ditambahkan pada media.  Perlakuan eksplan  dengan cara merendam eksplan dengan PVP atau merendam eksplan pada larutan PVP ditambah  agitasi selama 1jam.  pemakaian  PVP pada media, ditambahkan dengan konsentrasi 0,05% sampai dengan 1%.

pemakaian  antioksidan seperti asam askorbat paling berhasil  dalam perbanyakan secara in vitro terutama untuk tumbuhan  yang mengandung 

senyawa fenol tinggi seperti pisang ,  Asam askorbat juga berperan mengatasi kematian eksplan sesudah infeksi dengan Agrobacterium tumefaciens pada transformasi genetik secara in-vitro ,Asam askorbat  sebagai antioksidan yang 

 kuat, pemakan radikal bebas yang dihasilkan jaringan tumbuhan  saat  dilukai, maka  mencegah terjadinya oksidasi.  Asam askorbat  mencegah browning dengan cara menghambat proses 

oksidasi.   bahwa asam askorbat tidak 

berinteraksi secara langsung dengan enzim PPO, namun  pencegahan browning melalui mekanisme penurunan substrat yang teroksidasi, maka  memutus rantai oksidasi.Subkultur  (interval pendek) 2-3 kali yaitu  prinsip  yang paling mudah untuk mengatasi browning.   selama proses ini  luka irisan tertutup dan menghentikan eksudasi senyawa fenol.  Inkubasi awal kultur dalam gelap juga dapat mengatasi browning.  bahwa penyimpanan kultur dalam gelap dapat mencegah atau menurunkan aktifitas enzim yang 

terkait dengan biosintesis dan oksidasi fenol.

Vitrifikasi di sebabkan oleh kerusakan secara fisiologi  pada tumbuhan  sehingga menampilkan fenotip daun atau batang tumbuhan  glassy (bening, seperti gelas).  tumbuhan  hasil perbanyakan secara in-vitro kerap  menunjukkan fenotip seperti ini.  Keadaan ini  diikuti oleh nekrosis dan kematian jaringan eksplan ,

Vitrifikasi terjadi sebab  sel-sel tumbuhan  mengandung air yang berlebihan  (hyperhydricity), defisiensi klorofil,  kurangnya lignifikansi pada dinding sel.   faktor yang mempengaruhi 

terjadinya vitrifikasi pada tumbuhan  hasil perbanyakan in vitro yaitu  : jenis pemadat, hormon, senyawa organik , inorganik, suhu  

ruang kultur, cahayad, lingkungan botol kultur ,

Pada kultur tumbuhan  Chlorophytum borivilianum (jenis tumbuhan  obat),  hal hal yang  

mengurangi vitrifikasi yaitu  pemakaian  botol kultur yang memiliki aerasi; penurunan konsentrasi BAP dari 2 mg/L menjadi 0 mg/L  saat subkultur; pemakaian  sitokinin jenis kinetin dibandingkan jenis BAP.Uap air yang berlebihan pada botol kultur dapat memicu  vitrifikasi.    ini dapat dipicu    oleh matinya AC ruang kultur  sehingga memicu adanya uap air yang berlebih dalam botol kultur.